多管发酵法、种监中粪纸片法和酶底物法是测地目前测定地表水中粪大肠菌群的常用标准方法,通过三种方法对粪大肠菌群标准物质和实际地表水样进行分析检测,结果表明:多管发酵法、纸片法和酶底物法用于粪大肠菌群的表水标准检测结果具有一致性;通过三种方法优缺点的对比,多管法成本低适用于常规检测,纸片法高效方便更适用于大批量快速检测,酶底物法操作简单,不受场地限制可直接现场检测,更适用于应急现场监测。
前言
粪大肠菌群又称耐热大肠菌群，大肠的比是菌群较在44.5℃能生长并发酵乳酸产酸产气、需氧和兼性厌氧的种监中粪革兰氏阴性无芽孢杆菌。环境地表水中的测地粪大肠菌群主要来自粪便的污染，因此通过测定水中粪大肠菌群的表水标准含量，可间接得出水体受粪便污染的大肠的比情况，是菌群较当前国内外环境监测部门主要监测项目之一，是种监中粪评价水体污染程度和环境卫生的重要指标，在《地表水环境质量（GB3838—2002）》中，测地规定Ⅰ、表水标准Ⅱ、大肠的比Ⅲ、菌群较Ⅳ及Ⅴ类水粪大肠菌群的含量依次≤200、200～2000、2000～10000、10000～20000及20000～40000个/L，我国地表水体粪大肠菌群含量普遍较高，部分水域含量甚至超过Ⅴ类水质标准。
多管发酵法、纸片法和酶底物法是目前国内测定地表水中粪大肠菌群常用的标准方法。多管发酵法早在1985年就列入《生活饮用水标准检验方法（GB5750-85）》，并于2018年发布修订版，是粪大肠菌群测定的经典方法，它作为《水和废水监测分析方法（第四版）》中的推荐方法，美国公共卫生协会（APHA）出版的《水和废水标准检验方法（20版）》中方法9221E也采用的是多管发酵法；纸片法在西方发达国家运用较少，主要在一些发展中国家使用，环保部在2015年发布了纸片法的标准方法，它作为《水和废水监测分析方法（第四版）》中的推荐方法（C类方法）；酶底物法是一种新型酶技术检测方法，已在美、日、韩和欧洲许多国家使用,2003年从美国引入我国，环保部在2018年发布了酶底物法的标准方法。三种方法均是粪大肠菌群检测的标准方法，但在检出限、检测时间和操作过程等存在差异，本文参照环保行业标准，分别从粪大肠菌群标准物质和实际地表水样进行检测分析和对比研究，并从监测时间、成本、环境等总结出各方法的优缺点和适用范围，为广大环境监测分析人员根据实际条件和水样类型选择最佳方法分析测试提供借鉴与参考。
1实验部分
1.1试剂和材料
乳糖蛋白胨培养基，EC肉汤培养基，粪大肠纸片I、II型，粪大肠菌群有证标准物质，DST(deflned)MMO-MUG酶底物试剂，无菌水，阳性菌株：大肠埃希氏菌ATCC25922，阴性菌株：产气肠杆菌ATCC13048。
1.2仪器和设备
采样瓶，隔水式恒温培养箱：GNP-9160，恒温培养箱：HH.B11.420-135-Ⅱ，高压蒸汽灭菌器：YXQ-LS-100G，程控定量封口机：2009D,97孔定量盘，标准阳性比色盘，接种环，1mL移液管，试管：15mm×150mm。
1.3实验方法
多管发酵法HJ347.2—2018；纸片法HJ755—2015；酶底物法HJ1001—2018。
2实验结果与讨论
2.1空白对照
空白对照用无菌水做全程序空白测定。(1)多管发酵法：初发酵和复发酵的管中均无颜色变化，满足标准空白要求；(2)纸片法：培养后的纸片上无任何微生物生长，满足标准空白要求；(3)酶底物法：培养后的97孔定量盘中无颜色反应，满足H标准空白要求。
2.2阳性及阴性对照
按多管发酵法、纸片法和酶底物法三种方法实验要求进行培养，阳性菌株呈现阳性反应；阴性菌株呈现阴性反应。
2.3粪大肠菌群标准物质的结果（见表1)
由表1可知，三种方法对粪大肠菌群标准物质的六次测试结果均在可接受范围（83～312067MPN/L）内；从标准样品检测结果的相对标准偏差来看，多管发酵法为3.37%，纸片法为2.44%，酶底物法为1.87%，均满足各自对应方法标准中相对标准偏差的要求；从相对误差来看，多管发酵法为3.72%，纸片法为2.6%，酶底物法为3.34%，均满足各自对应方法标准中相对误差的要求。
2.4实际地表水样结果（见表2)
18个不同环境地表水样同时用多管发酵法、纸片法和酶底物法在相同条件下进行检测，为了使数据成正态分布，先对数据进行取对数后进行统计学分析，运用SPSS两两进行双样本配对t检验。
由表2数据可以看出，相关系数r分别为0.983、0.990、0.993，说明三组数据相关性较好；各组的t值分别为0.056、0.124、0.247，均小于t0.05(17)=2.110，说明三种方法对同一样品的分析结果无统计学意义上的显著性差异，即多管法、纸片法和酶底物法的实验结果具有一致性。
2.5三种方法的优缺点对比（见表3)
由表3可知，从实验操作来看，多管发酵法需要配置培养基并灭菌，进行复发酵，分析时间是48h左右、监测时间长、操作过程烦琐且在灭菌环境下检测；纸片法和酶底物法均可即时接种开始实验，较为简便，酶底物法接种的工作量明显比多管和纸片法少很多，效率最高，纸片法相比多管法而言无须进行复发酵，效率比多管法高。从仪器设备来看，纸片法只需要隔水培养箱，多管法和酶底物法除了隔水培养箱外，均还需要一个设备。从经济成本来看，单个样品的成本多管发酵法最低，其次为纸片法，酶底物法成本最高。
3结语
通过多管发酵法、纸片法和酶底物法对标准样品和实际地表水样的实验对比研究可知，同一样品三种方法对粪大肠菌群检测结果无统计学上显著性差异，其结果具有一致性。它们作为环保标准方法，各有优缺点，可根据不同的条件和要求选择合适的方法。多管发酵法和纸片快速法已经列为《国家地表水环境质量监测网监测任务作业指导书（试行）》的指定方法。
综上所述，多管发酵法应用最为广泛，适用于水样稀释倍数未知的情况和环境监测部门的常规检测；纸片法更适用于大批量样品的快速检测；酶底物法虽成本昂贵，但操作简单，对检测环境没有特殊要求，更适用于环境事故应急监测。
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